Трудности науки в исследовании вирусов. Проблемы электронной микроскопии

Ориентировочное время чтения: 24 мин.
 
Ссылка на статью будет выслана вам на E-mail:
Введите ваш E-mail:

Огромная проблема для вирусологов заключается в том, что у них нет никакой возможности утверждать, что то, что они представляют в качестве доказательства существования «вируса», имеет какое-либо отношение к природным частицам, которые встречаются “in vivo” или внутри живого организма. Многочисленные изменяющие клетки химические вещества/антибиотики и чужеродная животная РНК, которая впоследствии смешивается с оригинальным неочищенным образцом (мазком) от больного человека, немедленно уничтожают любые претензии на очищение. Тот факт, что так много добавлено к образцу, разрушает утверждение об изоляции.

Если процесса культивирования клеток недостаточно для того, чтобы изменить образец за пределами его первоначального состояния, то разрушение естественной морфологии клеток, вызванное подготовкой образца для изображений просвечивающего электронного микроскопа, гарантирует, что это так и есть. Ниже выделены некоторые из этапов (фиксация и встраивание), через которые проходит уже измененный образец клеточной культуры для подготовки к визуализации:

«Исследования в области вирусологии идут рука об руку с развитием методов микроскопии. Среди них большую роль сыграла электронная микроскопия (ЭМ) из-за малого размера вирусных частиц, которые, за очень редким исключением, не могут быть визуализированы обычной световой микроскопией [1,2,3,4]. До изобретения электронного микроскопа в 1931 году немецкими инженерами Эрнстом Руской и Максом Кноллем [5] ВИРУСЫ ОБНАРУЖИВАЛИСЬ ОПОСРЕДОВАННО, например, ПОСРЕДСТВОМ ЦИТОПАТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА, КОТОРЫЙ ОНИ ВЫЗЫВАЮТ В ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ, ИЛИ ЧЕРЕЗ КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ. Однако наличие ЭМ позволило нам визуализировать и идентифицировать многие инфекционные агенты, вызывающие заболевания или живущие “в симбиозе” с другими организмами. Таким образом, в течение 20-го века ЭМ была стандартной методикой диагностики вирусов (обзоры [6,7,8,9]).»

«Подготовка клеток к ЭМ должна следовать одной главной цели — СОХРАНИТЬ УЛЬТРАСТРУКТУРУ В СОСТОЯНИИ, МАКСИМАЛЬНО ПРИБЛИЖЕННОМ К МОМЕНТАЛЬНОМУ СНИМКУ ЖИВЫХ СОСТОЯНИЙ. Цитируя Гарета Гриффитса, первопроходца в использовании ЭМ [14]: “клеточная структура должна быть сохранена точно такой, какой она была в живом состоянии, и должна быть визуализирована на пределе разрешения электронного микроскопа”. Для достижения этой цели существует несколько методов и разработаны стандартные рецепты. Хотя они очень полезны для рутинного применения, они должны часто модифицироваться при решении конкретных биологических вопросов.»

«Стандартный метод подготовки клеток к рутинной ЭМ включает следующие этапы: ФИКСАЦИЯ, ВСТРАИВАНИЕ и СЕКЦИОНИРОВАНИЕ. Они будут подробно описаны ниже и обобщены на рис.1.»

2.1. ФИКСАЦИЯ КЛЕТОК

Первым и наиболее важным шагом для визуализации биологических объектов с помощью ЭМ является фиксация, поскольку ОНА ОПРЕДЕЛЯЕТ, НАСКОЛЬКО БЛИЗКО ИЗОБРАЖЕНИЕ, ВИДИМОЕ В МИКРОСКОП, НАПОМИНАЕТ СТРУКТУРУ IN VIVO. ЦЕЛЬ СОСТОИТ В ТОМ, ЧТОБЫ ИЗБЕЖАТЬ ИЛИ УМЕНЬШИТЬ ПОГРЕШНОСТИ, ВЫЗВАННЫЕ ЭКСТРАКЦИЕЙ, ДЕНАТУРАЦИЕЙ, СТЕРИЧЕСКИМИ ПОМЕХАМИ, ХИМИЧЕСКИМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ ЭПИТОПОВ (особенно важными для иммуноцитохимического анализа) И ИЗМЕНЕНИЯМИ ОБЪЕМА И ФОРМЫ (критичными для методов 3D-анализа, описанных в этом обзоре) [14]. Фиксация клеток может осуществляться двумя различными способами: химической фиксацией (рис. 1А) или крио-иммобилизацией (т. е. физической фиксацией; рис. 1Б).

«2.1.1 ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ

Химическая фиксация клеток обычно осуществляется буферными альдегидами. На этом этапе альдегиды создают межмолекулярную и внутримолекулярную сеть ковалентных взаимодействий (“перекрестных связей”), главным образом между аминогруппами, которые стабилизируют биологический образец. Это приводит к образованию большой трёхмерной сети необратимых поперечных связей по всей цитоплазме за время от десятых долей секунды до нескольких минут.

В то время как большинство лабораторий имеют свои собственные предпочтения, ГЛУТАРОВЫЙ АЛЬДЕГИД (ГА) ЛИБО САМ ПО СЕБЕ, ЛИБО В СОЧЕТАНИИ С ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ (ПФА) ЯВЛЯЮТСЯ НАИБОЛЕЕ ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ ПЕРВИЧНЫМИ ФИКСАТОРАМИ. Однако ГА индуцирует разветвлённую сеть перекрёстных связей, которые стерически препятствуют доступности антител к антигену. По этой причине формальдегид, который меньше маскирует антигенность, в основном используется для иммуноцитохимических исследований, таких как иммунофлуоресценция [14].

Во время всех этапов обработки очень важно, чтобы клетки не высыхали. Это особенно важно перед фиксацией, до первоначального контакта с фиксатором, когда клетки ещё живы. ХОТЯ ПРОЦЕСС ФИКСАЦИИ УБИВАЕТ КЛЕТКИ, КЛЕТКИ ДОЛЖНЫ УМИРАТЬ “ДОЛЖНЫМ ОБРАЗОМ”, ЧТОБЫ ГАРАНТИРОВАТЬ, насколько это возможно, ЧТО ВСЕ КЛЕТОЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ СОХРАНЯЮТСЯ ТАК ЖЕ ХОРОШО, КАК КОГДА ОНИ БЫЛИ ЖИВЫ. Для достижения этой цели можно было бы принять во внимание несколько других факторов. Следовательно, чистота альдегидов также имеет решающее значение. Поэтому рекомендуется использовать альдегиды уровня ЭМ, предоставляемые коммерческими поставщиками. Кроме того, на склеивающую способность этих альдегидов влияют время, концентрация и температура [19]. Рутинную фиксацию проводят в течение 15-30 мин при комнатной температуре с использованием буфера с физиологическим рН (6,8–7,4) и концентрацией не менее 0,1 М (моль/л) [14]. Природа буфера играет также очень важную роль при фиксации: например, наиболее широко используются какодилат натрия, фосфат натрия, ГЭПЭС (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтаносульфоновая кислота) и ПИПЭС (пиперазин-N, N’-бис(2-этансульфоновая кислота)).»

“К СОЖАЛЕНИЮ, ОБЩЕГО РЕЦЕПТА ХИМИЧЕСКОЙ ФИКСАЦИИ НЕ СУЩЕСТВУЕТ. НАИЛУЧШИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ТРЕБУЮТ АДАПТАЦИИ К ИНДИВИДУАЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ ЭКСПЕРИМЕНТА. Поэтому мы рекомендуем проконсультироваться со специалистом по ЭМ или свериться с литературой, чтобы помочь вам выбрать оптимальные условия (включая тип и концентрацию альдегида; тип, концентрацию и рН буфера; время и температуру фиксации), адаптированные для ваших экспериментов.

После фиксации клетки промывают предпочтительным буфером, в котором клетки могут храниться при температуре 4 °С до дальнейшей обработки. Обратите внимание, что культивируемые клетки могут быть приготовлены для ЭМ в виде монослоев или гранул (рис. 1А). Когда клетки далее обрабатываются в виде гранул, они должны быть соскоблены с чашки клеточной культуры после фиксации, если они не растут в суспензии. Альтернативно, для крио-ЭМ культивируемые клетки могут быть “трипсинизированы” перед фиксацией (рис. 1Б). СЛЕДУЕТ ИМЕТЬ В ВИДУ, ЧТО ГРАНУЛИРОВАНИЕ КЛЕТОК ИЗМЕНЯЕТ ИХ МОРФОЛОГИЮ И МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К ОШИБКАМ (Рис. 2).»

«ОСНОВНЫМ НЕДОСТАТКОМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИКСАЦИИ ЯВЛЯЕТСЯ ТО, ЧТО ОНА ИЗМЕНЯЕТ СТРУКТУРУ КЛЕТКИ, ОБРАЗУЯ СЕТКУ СШИТЫХ МОЛЕКУЛ. ТАКАЯ СЕТКА ПОДВЕРЖЕНА ОШИБКАМ, что является серьёзной проблемой для большинства исследований на основе ЭМ (подробное обсуждение этой темы см. в [21]). Тем не менее химическая фиксация была основой ЭМ на протяжении десятилетий, поскольку она ДОСТАТОЧНО ХОРОШО СОХРАНЯЕТ МОРФОЛОГИЮ КЛЕТОК.»

«Как уже указывал Смолл 34 года назад [24], БОЛЬШИНСТВО УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МОЖЕТ ПРОИСХОДИТЬ ВО ВРЕМЯ ПОСТФИКСАЦИОННОЙ ОБРАБОТКИ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ВСТРАИВАНИЯ (описанной ниже), А НЕ ВО ВРЕМЯ ФИКСАЦИИ. Таким образом, индивидуальный протокол должен быть разработан для максимальной сохранности интересующих клеток/тканей, включая как оптимальные условия фиксации, так и условия после фиксации.»

«2.1.2 КРИОФИКСАЦИЯ

Методы замораживания представляют собой альтернативу СКЛОННОЙ К ПОГРЕШНОСТЯМ ХИМИЧЕСКОЙ ФИКСАЦИИ (рассмотренной в работе [25]). Основной принцип заключается в том, чтобы остановить клетки путём быстрого охлаждения, процесс, который занимает несколько миллисекунд, что приводит к одновременной стабилизации всех клеточных компонентов без изменения их окружающей среды. Простейший способ заключается в погружении клеток, растущих на ЭМ-сетках, в жидкий этан или пропан путём погружения [26,27] и струйного замораживания [28,29,30,31,32] соответственно (рис. 1Б). Неотъемлемым ограничением этих подходов к быстрому охлаждению является то, что образцы могут быть покрыты только на глубину микрометров от их поверхности [33,34,35]. Это связано с плохой теплопроводностью воды: высокие скорости поверхностного охлаждения быстро распадаются внутри образца, достигая низкого значения, что вызывает кристаллизацию воды [36,37,38]. КРИСТАЛЛЫ ЛЬДА ИЗМЕНЯЮТ УЛЬТРАСТРУКТУРУ ЦИТОПЛАЗМЫ, ВЫЗЫВАЯ ФАЗОВУЮ СЕГРЕГАЦИЮ МЕЖДУ ВОДОЙ И РАСТВОРЕННЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ [37,39]. ЕЩЁ ХУЖЕ ТО, ЧТО РОСТ КРИСТАЛЛОВ ЛЬДА МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К ОБРАЗОВАНИЮ ДЫР В МЕМБРАНАХ И РАЗРУШЕНИЮ ОРГАНЕЛЛ [40].»

«2.2.1 ВСТРАИВАНИЕ ХИМИЧЕСКИ НЕПОДВИЖНЫХ ЯЧЕЕК

После химической фиксации клетки должны быть дополнительно обработаны, чтобы проанализировать их с помощью ЭМ. Из-за низкой мощности рассеяния электронов биологические образцы по своей природе обладают низким контрастом [56]. Поэтому тяжёлые металлы, такие как тетроксид осмия (OsO4) и уранилацетат (UA), обладающие высоким сродством ко многим клеточным структурам, используются после фиксации в качестве контрастных агентов при рутинной ЭМ. Благодаря своей реакционной способности с ненасыщенными ацильными цепями мембранных липидов OsO4, например, способствует удержанию липидов [57,58], в дополнение к своей роли в контрастных структурах (особенно мембранах). Аналогично, Сильва и др. [59] показали, что UA играет определённую роль в защите липидов от экстракции растворителем.»

«Как было сказано ранее, на ультраструктурную сохранность клеток влияет не только способ фиксации, но и последующие стадии обработки (дегидратация, инфильтрация и полимеризация смолы). В РЕЗУЛЬТАТЕ ДЕНАТУРИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ЭТИХ СТАДИЙ ОБРАБОТКИ СТРУКТУРЫ РЕДКО СОХРАНЯЮТСЯ В ТОМ ОБЪЁМЕ, В КАКОМ ОНИ ПОЯВЛЯЮТСЯ IN VIVO».

Обратите внимание, что и фиксация, и встраивание, как известно, изменяют морфологию клеток, Вносят ошибки и редко сохраняют структуры в том виде, в каком они появляются “in vivo”. Помните, что эти шаги являются дальнейшим изменением, которое было сделано в исходном образце после процесса культивирования высокотоксичных клеток.

Здесь нет ни попыток очищения, ни изоляции. Существуют миллиарды одинаковых частиц, которые могут присутствовать. Вирусологи выбирают любую сильно изменённую частицу, которая соответствует форме или идее «вируса», которую они хотят найти, и делятся ею как доказательством упомянутого «вируса».» Они не принимают во внимание, что эти частицы, скорее всего, изначально не были частью исходного образца и что они были созданы в процессе культивирования, фиксации и внедрения. Они принимают форму, функцию и патогенность, даже не доказывая этого.

Вот почему очистка/выделение неизмененного образца непосредственно от больного пациента является единственным способом гарантировать, что то, что изображается, имеет какое-либо отношение к делу.

Ссылки:
Zhou, Z.H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 2008, 18, 218–228. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Cheng, Y.; Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 2009, 78, 723–742. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Wolf, M.; Garcea, R.L.; Grigorieff, N.; Harrison, S.C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 6298–6303. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Bharat, T.A.; Davey, N.E.; Ulbrich, P.; Riches, J.D.; de Marco, A.; Rumlova, M.; Sachse, C.; Ruml, T.; Briggs, J.A. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature 2012, 487, 385–389. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Ruska, E. Nobel lecture. The development of the electron microscope and of electron microscopy. Biosci. Rep. 1987, 7, 607–629. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Biel, S.S.; Gelderblom, H.R. Diagnostic electron microscopy is still a timely and rewarding method. J. Clin. Virol. 1999, 13, 105–119. [Google Scholar] [CrossRef]

Curry, A.; Appleton, H.; Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: Present and future. Micron 2006, 37, 91–106. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Goldsmith, C.S.; Miller, S.E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2009, 22, 552–563. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Gentile, M.; Gelderblom, H.R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: An update. New Microbiol. 2014, 37, 403–422. [Google Scholar] [PubMed]

Hazelton, P.R.; Gelderblom, H.R. Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations. Emerg. Infect. Dis. 2003, 9, 294–303. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Roingeard, P. Viral detection by electron microscopy: Past, present and future. Biol. Cell 2008, 100, 491–501. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Biel, S.S.; Madeley, D. Diagnostic virology—The need for electron microscopy: A discussion paper. J. Clin. Virol. 2001, 22, 1–9. [Google Scholar] [CrossRef]

Risco, C.; de Castro, I.F.; Sanz-Sanchez, L.; Narayan, K.; Grandinetti, G.; Subramaniam, S. Three-dimensional imaging of viral infections. Annu. Rev. Virol. 2014, 1, 453–473. [Google Scholar] [CrossRef]

Griffiths, G. Fine Structure Immunocytochemistry; Springer: Berlin, Germany; Heidelberg, Germany, 1993. [Google Scholar]

Hayat, M.A. Fixation for Electron Microscopy; Academic Press: New York, NY, USA, 1981. [Google Scholar]

Steinbrecht, R.A.; Zierold, K. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy; Springer-Verlag: Berlin, Germany; Heidelberg, Germany, 1987. [Google Scholar]

Verkleij, A.J.; Leunissen, J.L.M. Immuno-Gold Labeling in Cell Biology; CRC Press, Inc.: Boca Raton, FL, USA, 1989. [Google Scholar]

Laue, M. Electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 2010, 96, 1–20. [Google Scholar] [PubMed]

Flitney, F.W. The time course of the fixation of albumin by formaldehyde, glutaraldehyde, acrolein and other higher aldehydes. J. R. Micros. Soc. 1966, 85, 353–364. [Google Scholar] [CrossRef]

Romero-Brey, I.; Merz, A.; Chiramel, A.; Lee, J.Y.; Chlanda, P.; Haselman, U.; Santarella-Mellwig, R.; Habermann, A.; Hoppe, S.; Kallis, S.; et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLoS Pathog. 2012, 8, e1003056. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Hayat, M.A. The production of artifacts. Ultrastruct. Pathol. 1981, 2, 93. [Google Scholar] [PubMed]

McDowall, A.W.; Chang, J.J.; Freeman, R.; Lepault, J.; Walter, C.A.; Dubochet, J. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 1983, 131 Pt 1, 1–9. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

McDowall, A.; Gruenberg, J.; Romisch, K.; Griffiths, G. The structure of organelles of the endocytic pathway in hydrated cryosections of cultured cells. Eur. J. Cell Biol. 1989, 49, 281–294. [Google Scholar] [PubMed]

Small, J.V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: Influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. J. Cell Biol. 1981, 91 3 Pt 1, 695–705. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Studer, D.; Humbel, B.M.; Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem. Cell Biol. 2008, 130, 877–889. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Adrian, M.; Dubochet, J.; Lepault, J.; McDowall, A.W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 1984, 308, 32–36. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, J.J.; Homo, J.C.; Lepault, J.; McDowall, A.W.; Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 1988, 21, 129–228. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Muller, M.; Meister, N.; Moor, H. Freezing in a propane jet and its application in freeze-fracturing. Mikroskopie 1980, 36, 129–140. [Google Scholar] [PubMed]

Giddings, T.H., Jr.; Staehelin, L.A. Ribosome binding sites visualized on freeze-fractured membranes of the rough endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 1980, 85, 147–152. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Espevik, T.; Elgsaeter, A. In situ liquid propane jet-freezing and freeze-etching of monolayer cell cultures. J. Microsc. 1981, 123 Pt 1, 105–110. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Swales, L.S.; Lane, N.J. Insect intercellular junctions: Rapid freezing by jet propane. J. Cell Sci. 1983, 62, 223–236. [Google Scholar] [PubMed]

Haggis, G.H. Study of the conditions necessary for propane-jet freezing of fresh biological tissues without detectable ice formation. J. Microsc. 1986, 143 Pt 3, 275–282. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Galway, M.E.; Heckman, J.W., Jr.; Hyde, G.J.; Fowke, L.C. Advances in high-pressure and plunge-freeze fixation. Methods Cell Biol. 1995, 49, 3–19. [Google Scholar] [PubMed]

Nitta, K.; Kaneko, Y. Simple plunge freezing applied to plant tissues for capturing the ultrastructure close to the living state. J. Electron Microsc. (Tokyo) 2004, 53, 677–680. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Richter, T.; Biel, S.S.; Sattler, M.; Wenck, H.; Wittern, K.P.; Wiesendanger, R.; Wepf, R. Pros and cons: Cryo-electron microscopic evaluation of block faces versus cryo-sections from frozen-hydrated skin specimens prepared by different techniques. J. Microsc. 2007, 225 Pt 2, 201–207. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Shimoni, E.; Muller, M. On optimizing high-pressure freezing: From heat transfer theory to a new microbiopsy device. J. Microsc. 1998, 192 Pt 3, 236–247. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 2007, 79, 7–21. [Google Scholar] [PubMed]

Studer, D.; Michel, M.; Wohlwend, M.; Hunziker, E.B.; Buschmann, M.D. Vitrification of articular cartilage by high-pressure freezing. J. Microsc. 1995, 179 Pt 3, 321–332. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Allison, D.P.; Daw, C.S.; Rorvik, M.C. The construction and operation of a simple inexpensive slam freezing device for electron microscopy. J. Microsc. 1987, 147 Pt 1, 103–108. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Meryman, H.T. Cryopreservation of living cells: Principles and practice. Transfusion 2007, 47, 935–945. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. In Cryotechniques in Biological Electron Microscopy; Steinbrecht, R.A., Zierold, K., Eds.; Sringer: Berlin, Germany; Heidelberg, Germany, 1987; pp. 175–191. [Google Scholar]

Studer, D.; Michel, M.; Muller, M. High pressure freezing comes of age. Scanning Microsc. Suppl. 1989, 3, 253–268. [Google Scholar] [PubMed]

Vanhecke, D.; Graber, W.; Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 2008, 88, 151–164. [Google Scholar] [PubMed]

Al-Amoudi, A.; Dubochet, J.; Studer, D. Amorphous solid water produced by cryosectioning of crystalline ice at 113 K. J. Microsc. 2002, 207 Pt 2, 146–153. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Eppenberger-Eberhardt, M.; Riesinger, I.; Messerli, M.; Schwarb, P.; Muller, M.; Eppenberger, H.M.; Wallimann, T. Adult rat cardiomyocytes cultured in creatine-deficient medium display large mitochondria with paracrystalline inclusions, enriched for creatine kinase. J. Cell Biol. 1991, 113, 289–302. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Verkade, P. Moving EM: The rapid transfer system as a new tool for correlative light and electron microscopy and high throughput for high-pressure freezing. J. Microsc. 2008, 230 Pt 2, 317–328. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Kingsley, R.E.; Cole, N.L. Preparation of cultured mammalian cells for transmission and scanning electron microscopy using Aclar film. J. Electron Microsc. Tech. 1988, 10, 77–85. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Masurovsky, E.B.; Bunge, R.P. Aclar film in biological electron mircoscopy. J. Electron Microsc. Tech. 1989, 12, 172–173. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Jimenez, N.; Humbel, B.M.; van Donselaar, E.; Verkleij, A.J.; Burger, K.N. Aclar discs: A versatile substrate for routine high-pressure freezing of mammalian cell monolayers. J. Microsc. 2006, 221 Pt 3, 216–223. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Schauflinger, M.; Villinger, C.; Mertens, T.; Walther, P.; von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 2013, 15, 305–314. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Hohenberg, H.; Mannweiler, K.; Muller, M. High-pressure freezing of cell suspensions in cellulose capillary tubes. J. Microsc. 1994, 175 Pt 1, 34–43. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Sherman, M.B.; Trujillo, J.; Leahy, I.; Razmus, D.; Dehate, R.; Lorcheim, P.; Czarneski, M.A.; Zimmerman, D.; Newton, J.T.; Haddow, A.D.; et al. Construction and organization of a BSL-3 cryo-electron microscopy laboratory at UTMB. J. Struct. Biol. 2013, 181, 223–233. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Sosinsky, G.E.; Crum, J.; Jones, Y.Z.; Lanman, J.; Smarr, B.; Terada, M.; Martone, M.E.; Deerinck, T.J.; Johnson, J.E.; Ellisman, M.H. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J. Struct. Biol. 2008, 161, 359–371. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Fontana, J.; Lopez-Iglesias, C.; Tzeng, W.P.; Frey, T.K.; Fernandez, J.J.; Risco, C. Three-dimensional structure of Rubella virus factories. Virology 2010, 405, 579–591. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Murk, J.L.; Posthuma, G.; Koster, A.J.; Geuze, H.J.; Verkleij, A.J.; Kleijmeer, M.J.; Humbel, B.M. Influence of aldehyde fixation on the morphology of endosomes and lysosomes: Quantitative analysis and electron tomography. J. Microsc. 2003, 212 Pt 1, 81–90. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Vale, F.F.; Correia, A.C.; Matos, B.; Moura Nunes, J.F.; Alves de Matos, A.P. Applications of transmission electron microscopy to virus detection and identification. In Microscopy: Science. Technology, Applications and Education; Mendez-Vilas, A., Diaz, J., Eds.; FORMATEX: Badajoz, Spain, 2010; pp. 128–136. [Google Scholar]

Stoeckenius, W.; Mahr, S.C. Studies on the reaction of osmium tetroxide with lipids and related compounds. Lab. Invest. 1965, 14, 1196–1207. [Google Scholar] [PubMed]

Korn, E.D. Structure of biological membranes. Science 1966, 153, 1491–1498. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Silva, M.T.; Guerra, F.C.; Magalhaes, M.M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia 1968, 24, 1074. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed]

Автор: Майк Стоун (Mike Stone)

Источник: MDPI

Перевод: Алёна Басарева специально для МедАльтернатива.инфо

Материалы в тему


Рекомендуем прочесть нашу книгу:

Наша книга Диагноз – рак: лечиться или жить? Альтернативный взгляд на онкологию

Чтобы максимально быстро войти в тему альтернативной медицины, а также узнать всю правду о раке и традиционной онкологии, рекомендуем бесплатно почитать на нашем сайте книгу "Диагноз – рак: лечиться или жить. Альтернативный взгляд на онкологию"


Мы распространяем правду и знания. Если вы считаете нашу работу полезной и готовы оказать финансовую помощь, то вы можете перевести любую посильную для вас сумму. Это поможет распространению правдивой информации о раке и других болезнях и может спасти чьи-то жизни. Участвуйте в этом важном деле помощи людям!

Оставьте комментарий

Войти с помощью: